HILIC模式单一介绍

HILIC是一种色谱分离技术-亲水作用色谱（hydrophilic-interaction chromatography）的简称
，也称为非水反相色谱或者反反相色谱
，由Alpert教授于1990年提出
，并将HILIC模式和正相模式（NPLC）进行了分辨^[1]。

HILIC模式和正相有着类似的洗脱方式
，由于使用了反相溶剂系统（水和有机相）
，从而具备正相所没有的优势
，例如系统中能够含水
，对于化合物的稀释剂选择更多
，巢轮性更好
，能够衔接MS进行联用等等（HILIC模式含有高比例有机相
，相迸宗水相更多的反相
，更容易去溶剂化
，增长离子化效能
，提高活络度
，如图1所示）。HILIC模式能够预防使用离子对试剂
，对于大极性化合物的造备很有益。HILIC模式宽泛利用于大极性化合物的分离
，例如药物、糖类、蛋白、多肽、氨基酸等等。

图1：分歧模式对化合物的利用领域

HILIC模式作用机理

HILIC的保留机造是液液分配、吸附作用、离子相互作用和亲水性保留作用等多种模式作用的综合体现
，化合物的保留通常受其化学性质和结构、固定相和流动相作用以及流动相种类（有机溶剂种类以及流动相pH）影响。

HILIC模式的色谱柱的固定相选取未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子、环糊精类、聚琥珀酰亚胺键合物质等极性填料
，所以化合物的保留强度和其极性成正比
，和流动相极性成反比。极性溶剂的存在能够使固定相表表形成一层极性层
，如图2所示
，因而对于利用液液分配作用进行保留的化合物
，流动相中极性溶剂是必不成少的
，通常至少蕴含3%极性溶剂 ^[2]。

图2：胞嘧啶在流动相和固定相表表吸附水层液液分配

在流动相中增长缓冲盐和增长剂也是常用伎俩
，有助于改善峰型和保留
，缓冲盐在面对固定相表表极性层和非极性溶剂时
，越发偏差于溶化于极性层
，随着盐浓度增长从而增长其亲水性
， ^[3]。

其中
，甲酸铵和乙酸铵是最常用的缓冲盐
，这得益于它们在有机溶剂中优良的溶化性以及MS兼容性。需把稳的是
，随着盐浓度的提高
，化合物和固定相的离子作用会受到抑造
，重要作用为液液分配 ^[4~7]
，这就导致碱性化合物的保留减弱
，是由于大量的阴离子和碱性化合物配对形成中性离子对更容易溶于有机相；相反
，酸性化合物保留则会增长
，是由于带负电的硅醇离子倾轧作用减弱
，从而与固定相作用加强。

一些固定相填料表表上拥有带电硅醇
，拥有肯定酸性
，在pH5~9时
，硅醇基团就处于电离状态
，对于带电状态的化合物离子互换作用将表演沉要角色 ^[3]。需把稳的是
，由于HILIC模式下拥有高比例有机相
，高或低pH的缓冲盐溶于其中时
，其真实pH值会由缓冲盐pH值向中性靠近1~1. ^[8]
，使化合物处于电离状态的pH值
，更利于化合物的保留。

通常酸性化合物在高pH（常用氨水、碳酸氢铵等）前提下保留强于低pH前提
，碱性化合物在低pH（常用乙酸、甲酸、乙酸铵、甲酸铵等）前提下保留较好。

HILIC模式溶剂选择

HILIC模式洗脱溶剂强度为：四氢呋喃 < 丙酮 < 乙腈 < 异丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水（由弱至强）
，如图3所示
，四氢呋喃、丙酮和乙腈洗脱能力最弱
，可作为重要溶剂使用
，由于丙酮的截止波长330nm过高
，在UV检测器使用受限（可用于CAD、ELSD、MS等）
，而乙腈长短质子溶剂
，可能增长化合物和固定相表表极性层的氢键作用
，从而增长保留
，因而作为最常用流动相之一
，相当于反相中的水相
，水的洗脱能力最强
，常作为洗脱溶剂使用
，可凭据化合物保留情况选择相宜的洗脱溶剂。

图3：HILIC模式洗脱溶剂强弱挨次

HILIC模式当苦衷项

01 稀释剂

通常建议选择流动相肇始比例溶化样品。由于HILIC模式乙腈的比例较高
，好多大极性化合物难以溶化
，为了保障化合物溶化
，通；峤蠹匀芗痢缢⒓状嫉抛τ糜谙∈图。在这种情况下和通例反相分离类似
，HILIC模式使用强洗脱稀释剂时也会导致溶剂效应问题。而二甲基亚砜（DMSO）作为稀释剂
，拥有肯定保留
，并且DMSO在低波长下有较强的吸收
，可能会影响指标化合物出峰
，通常共同乙腈、甲醇使用
，DMSO比例通常不超过25%。

通例能够思考使用75%的乙腈和25%的甲醇混合液作为稀释剂
，也能够加一些增长剂助溶
，如甲酸等。需把稳的是
，样品的含水量若是过大
，也会影响化合物出峰情况。

02 洗针液

由于大极性化合物的保留极易受大极性洗脱试剂的影响
，有时洗针液中的残留洗濯溶剂会对化合物出峰产生影响
，或者步骤难以沉现
，通常建议选取流动相肇始比例洗针。

03 流动相

为保障在分析过程中离子强度的不变
，能够在水相和有机相均参与同样浓度的增长剂
，也能够思考预混
，需把稳的是
，在流动相配造过程中
，混合后常；岵露缺涠
，使用前需搁置至室温。

04 色谱柱再生

色谱柱使用一段功夫后
，样品可能会残留在柱头梗塞柱筛板
，这时能够思考选取高浓度缓冲盐低流速进行反冲。以默克色谱柱SeQuant? ZIC-HILIC为例
，首先选取30倍柱体积的超纯水进行冲刷
，再用30倍柱体积的缓冲盐（能够用500mM乙酸铵溶液）进行冲刷
，最后再用30倍柱体积的超纯水进行冲刷
，分歧填料处置可能分歧。

HILIC模式步骤开发

对于未知化合物步骤开发
，可选取如图4所示的通常思路进行。需把稳的是由于HILIC模式化合物保留方式特殊
，固定相的极性水层起源于流动相
，梯度不能变动过快
，柱平衡必要留一按功夫。

图4：HILIC模式未知化合物步骤开发通常思路

对于已知化合物
，则能够凭据化合物性质进行选择
，首先判断酸碱性
，能够用ACD进行仿照
，从而进行色谱柱的选择。

表1 色谱柱填料及利用领域

JDB电子经典案例

01 胺类化合物

氨丁三醇在通例反相系统下没有保留
，并且没有紫表吸收
，遂选取HILIC模式
，选择CAD检测器进行步骤开发。氨丁三醇峰型优良
，对称因子1.2（如图5所示）
，线性有关系数r 可做到1.000
，回收率在97%~104%之间。

图5：氨丁三醇典型图谱

02 氨基酸检测

氨基酸大多是幼分子两性化合物
，在通例反相分离模式下保留很弱
，通常选取衍生法进行检测
，好比寺返氨酸
，其 pKa 和 logD 见下图：

图6：赖氨酸 pKa

图7：赖氨酸 logD

赖氨酸的 logD 在所有前提下都是负值
，通例反相系统无法产生保留行为
，我们选取HILIC模式解决了赖氨酸的分析检测
，得到了优良的保留（8min）和峰型（拖尾因子1.6）
，大大降低分析成本
，便于步骤转移和检测（如图8所示）。

图8：赖氨酸典型图谱

03 大极性杂质

对于没有保留、没有紫表吸收、不能碰水、极性和主成分靠近的杂质
，该若何分析呢？JDB电子给出的答案是HILIC-MS模式。如葡甲胺的发补杂质中有一个席夫碱
，该化合物极性大、没有紫表吸收、见水易分化
，该杂质和葡甲胺极性靠近
，通例步骤难以分离。

选取HILIC-MS模式进行步骤开发
，最终葡甲胺和该席夫碱杂质分离度在2.8以上
，线性有关系数r为1.000
，200ppm的LOD信噪比最幼为25
，回收率在94%~103%之间
，且步骤耐用性优良
，各参数微幼变动下
，均可达到1.5以上基线分离
，回收率在98%~102%之间。

图9：分离度溶液典型图谱

JDB电子分析测试中心

JDB电子已成立美满的分析测试中心
，能够选取丰硕的设备和多种先进的技术（高分辨、LCMSMS、GCMSMS、CAD、NMR、离子色谱、双三元等等）满足客户的各项分析需要！

征询我们

（撰稿：李墨；编审：杜建
，毕增）

参考资料：

[1] Alpert, A. J., J. Chromatogr. 1990, 499, 177-196.
[2] Waters亲水作用色谱, Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain
[3] Jandera, P., J. Sep. Sci. 2008, 31, 1421–1437.

[4] Strege, M. A., Anal. Chem. 1998, 70, 2439-2445.
[5] McCalley, D. V., J. Chromatogr. A 2007, 1171, 46-55.
[6] Naidong, W., J. Chromatogr. B 2003, 796, 209-224.
[7] Liu, M., Ostovic, J., Chen, E. X., Cauchon, N., J. Chromatogr. A 2009, 1216, 2362-2370.
[8] Fountain, K. J., Xu, J., Diehl, D. M., Morrison, D., J. Sep. Sci. 2010, 33, 740-751.

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