酶联免疫吸附试验（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是生物医药研发与临床检测中常用的免疫学分析步骤之一
。作为专业的药物研发服务供给商，JDB电子ELISA尝试服务，为药物发现、临床前钻研及生物标志物检测提供高活络度、高特异性的技术支持
。

一、ELISA的根基道理

ELISA（酶联免疫吸附试验）的主题基础是抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶象征技术
。结合在固相载体表表的抗原或抗体仍维吃熹免疫学活性，而酶象征的抗原或抗体不仅保留其免疫学活性，同时也保留酶的活性
。

在测定过程中，ELISA步骤检测遵循以下贱程：受检标本（含待测抗体或抗原）与固相载体表表的抗原或抗体产生特异性反映 → 通过洗涤，可将固相载体上的抗原抗体复合物与液相中的其他物质分离 → 参与酶象征的抗原或抗体，其也可通过特异性反映结合于固相载体表表 → 固相载体上的酶量与标本中受检物质的含量呈肯定对应关系 → 参与酶反映底物后，底物在酶的催化作用下天生有色产品 → 凭据显色深浅进行定性或定量分析
。

由于酶拥有较高的催化效能，可间接放大免疫反映信号，从而使该检测步骤拥有较高的敏感性
。

ELISA的根基道理有三条：

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表表，可能是蛋白和聚苯乙烯表表间的疏水性部门相互吸附，并维吃熹免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶衔接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能维吃熹免疫学和酶学活性；

（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可凭据参与底物的色彩反映来判定是否有免疫反映的存在，并且色彩反映的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因而，能够按底物显色的水平显示试验了局
。

二、抗原和抗体

1、抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质
？乖牖搴，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫
。

2、抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)
。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE
。与免疫测定有关的Ig重要为IgG和IgM
。

三、ELISA的四种检测步骤

凭据分歧检测指标和样本个性，ELISA检测步骤重要分为以下四种类型
。选择相宜的检测步骤是保障尝试了局正确性的关键前提
。

1、直接法

直接法只能用来测定抗原 ：

①. 将抗原与固相载体衔接，洗涤除去未结合的抗原及杂质
。

②.加酶标抗体，保温反映
。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合
。彻底洗涤未结合的酶标抗体
。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量有关
。

③.加底物反映
。固相上的酶催化底物成为有色产品，此时底物的降解量＝抗原量
。

2、双抗夹心法

双抗夹心法，此法合用于测定二价或二价以上的大分子，但不合用于测半抗原抗体及幼分子单价抗原抗体，此法既能够测抗体又能够测抗原：

测抗原的道理：

①.将特异性抗体与固相载体衔接，形成固相抗体
。洗涤除去未结合的抗体及杂质
。

②.加受检标本，保温反映
。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物
。洗涤除去其它未结合物质
。

③.加酶标抗体，保温反映
。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合
。彻底洗涤未结合的酶标抗体
。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量有关
。

④.加底物反映
。固相上的酶催化底物成为有色产品
。通过比色，测知标本中抗原的量
。

双抗夹心法测抗体的反映模式与测抗原类似，用特异性抗原进行包被和造备酶结合物，以检测相应的抗体
。

3、间接法

道理：利用酶象征的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体
。

操作步骤：

①.将特异性抗原与固相载体连结，形成固相抗原
。洗涤除去未结合的抗原及杂质
。

②.加稀释的受检血清，保温反映
。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物
。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其它成份在洗涤过程中被洗去
。

③.加酶标抗体
。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地象征上酶
。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正有关
。

④.加底物显色
。

4、竞争法

道理：标本中的抗体（抗原）和肯定量的酶标抗体（抗原）竞争与固相抗原（抗体）结合
。标本中抗体（抗原）量越多，结合在固相上的酶标抗体（抗原）愈少，因而阳性反映呈色浅于阴性反映
。

四、ELISA尝试操作步骤

1、包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 通常为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1幼时后，4℃冰箱搁置16～18幼时
。

2、洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反映板颠倒在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽
。

3、加封关液200微升，37℃搁置一幼时
。

4、洗涤同步骤2
。

5、加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升
。同时作稀释液对照
。37℃搁置2幼时
。

6、洗涤同步骤2
。

7、加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 搁置37℃ 1幼时
。

8、洗涤同步骤2
。

9、加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟
。

10、加终止液：每孔50微升
。

11、观察了局：用酶联免疫检测仪纪录490nm读数
。

五、ELISA尝试当苦衷项

1、正式尝试时，应别离以阳性对照与阴性对照节造尝试前提，待检样品应作一式二份，以保障尝试了局的正确性
。有时本底较高，注明有非特异性反映，可选取羊血清、兔血清或BSA等封关
。

2、在ELISA中，进行各项尝试前提的选择是很沉要的，蕴含：

（1）固相载体的选择：

很多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等
。其大局可所以凹孔平板、试管等
。目前常用的是96孔聚苯乙烯凹孔板
。不论何种载体，在使用前均可进行筛
。河玫攘靠乖，在统一尝试前提下进行反映，观察其显色反映是否均一性，据此判明其吸附机能是否优良
。

（2）包被抗体(或抗原)的选择：

将抗体(或抗原)吸附在固相载体表表时，要求纯度要好,吸附时通常要求PH在9.0～9.6之间
。吸附温度，功夫及其蛋白量也有肯定影响,通常多选取4℃ 18～24幼时
。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用分歧的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验前提一样时，观察阳性标本的OD值
。选择OD值最大而蛋白量至少的浓度
。对于无数蛋白质来说通常为1～10μg／ml
。

（3）酶象征抗体工作浓度的选择：

首吓酌直接ELISA法进行初步效价的滴定
。而后再固定其它前提或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶象征抗体别离为分歧的稀释度)在正式尝试系统里正确地滴定其工作浓度
。

（4）酶的底物及供氢体的选择：

对供氢体的选择要求是价廉、安全、有显著地显色反映，而自身无色
。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，该把稳防护
。有前提者应使用不致癌、活络度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为中意的供氢体
。底物作用一段功夫后，应参与强酸或强碱以终止反映
。通常底物作用功夫，以10-30分钟为宜
。底物使用液必须新鲜配造，尤其是H2O2临用前参与
。

（5）样品：

通过查文件或预尝试或许确定标本中样品含量，再对样品进行稀释，加样
。

六、ELISA的特点

特点一：活络性

该测定法的活络度来自作为汇报基团的酶
。多所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反映 ，产生可供观察的显色反映景象
。因而该系统常被称为酶放大系统
。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的地点部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量
。

例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反映测定法的敏感度约为5~10μg/ml 
。

特点二：特异性

其特异性来自抗体或抗原的选择性
？乖固宓慕岷夏谌萆现徊诳乖目乖龆ù赜肟固宓目乖岷衔坏阒
。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反映拥有高度的特异性
。

若何正确的进行ELISA测定操作步骤

临床ELISA测定现通常为选取手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作极度单一，通常涉及到标本的网络保留、试剂筹备、加样、温育、洗板、显色、比色、了局判断和了局汇报及诠释等方面，其中任一步骤的不当城市影响测定了局，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚
。现分述如下
。

临床标本的网络和保留

用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时由于特定的检测主张，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本
。目前临床上使用血清标本测定的标志物通常有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和医治药物等
。对用于激素和医治药物测定的血清标本的网络，要把稳网络功夫甚或体位有可能会对测定了局产生影响
。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：成长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式开释，因而，在测定此类激素时，有必要在亲昵相连的功夫距离内采取数份血样本，以其中央值为测定值
。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现显著增高
。再如医治药物的检测，应凭据药代动力学选择服药后的最当令间抽血检测
。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的网络则没有功夫和体位方面的影响，只是在处置和保留方面要思考以下几个方面
。

（1）要把稳预防出现严沉溶血
。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因而，在以HRP为象征酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面参与的HRP底物反映显色
。

（2）样本的采集及血清分离中要把稳尽量预防细菌传染，一则细菌的成长，其所排泄的一些酶可能会匹敌原抗体等蛋白产生分化作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶自身会对用相应酶作象征的测定步骤产生非特异性滋扰
。

（3）血清标本如是以无菌操作分离，则能够在2～8℃下保留一周，如为有菌操作，则建议冰冻保留
。样本的长功夫保留，应在-70℃以下
。

（4）冰冻保留的血清标本须把稳预防因停电等造成的反复冻融
。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生粉碎作用，从而引起假阴性了局
。此表，冻融标本的混匀亦该把稳，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可
。

（5）标本在保留中如出现细菌传染所致的浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测
。

试剂筹备

在临床尝试室，对试剂筹备通常不太把稳，通常的做法是，在尝试时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影清脆面温育功夫不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性
。因而在ELISA测定中试剂的筹备最为关键的是，在尝试起头前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下搁置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡
。这样做的主张，重要是为了在后面的温育反映步骤中，能使反映微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求
。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在尝试室使用时对所提供的浓缩液稀释配造，因而稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保障质量
。此表，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反映显色前一时配造
。

加血清样本及反映试剂

在此刻的ELISA商品试剂盒中，血清样本的参与险些是唯一的要使用微量加样器参与样本的步骤
。使用微量加样器加样必须把稳的关键点是：加样不成太快，要预防加在孔壁上部，不成溅出和产生气泡
。加样太快，无法保障微量加样的正确性和均一性
。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附
。溅出会对邻近孔产生传染
。呈显禅泡则反映液界面有差距
。试剂的参与在国产试剂盒中根基上均是从滴瓶中滴加，除了要把稳滴加的角度表，滴加的速度也很沉要，滴加太快，很容易出现沉复滴加或加在两孔之间的景象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色
。所以，有时辰一份标本用一样的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的谬误所致
。

温育

温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个成分
。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反映在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原齐全结合，必须在肯定的温度前提下反映肯定的功夫
。温育所需功夫与温度成反比，即温度越高，则所需功夫相对较短
。最为常用的温育温杜仔37℃和室温，其次是43℃和2～8℃
。

温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤
。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反映温育功夫为37℃ 30分钟～1幼时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2幼时能力有较齐全的结合，低于1幼时，可能会影响测定下限
。因而，关于温育，在现实测定操作中肯定要把稳以下几点：

要保障在设定的温度下有足够的反映功夫
。通常来说，加完样本和/或反映试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，必要肯定的功夫，尤其是在室温比力低以及非水浴的状态下，这段升温功夫可能还比力长，而在临床尝试室中，很少有人把稳这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即起头计时，这样就很容易造成现实测定中温育功夫不够，弱阳性样本测不出来的问题
。曾有一地处南方的血站同业提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的功夫，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供给的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原由于何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育功夫不够，以至弱阳性样本测定为阴性
。因而，为保障37℃下足够的温育功夫，临床尝试室可自行确定本尝试室分歧季节（分歧室温下）微孔板从室温拿至温箱后必要多长功夫孔内温度能力达到37℃，从而适当耽搁板条在温箱中的搁置功夫
。具体的做法是，用一幼温度计搁置板孔反映溶液中丈量观察即可
。

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