细胞免疫职能检测

基础理论:本技术用于评估T细胞对各类刺激

2017-09-04

接见量：

T细胞增殖职能测定

基础理论:本技术用于评估T细胞对各类刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反映T细胞职能的一个沉要指标。

刺激T细胞增殖的成分及意思

1. 特异性抗原：引起寡克隆活化增殖？擞糜谂卸峡乖庖叩某尚Вㄒ呙缃又郑┖突毓朔从衬芰，也能反映T细胞总体的职能。

2. 丝裂原：多克隆。

3. 刺激信号转导分子：多克隆。

T细胞增殖测定步骤

1. 显微镜下观察细胞状态与细胞计数。

2. 放射性核素掺入试验。

细胞增殖时，DNA复造，须从造就液中补充核苷酸。用放射性核素象征造就液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），当DNA复造时， 3HTdR掺入在割裂的细胞的DNA中。细胞增殖程杜纂细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定造就细胞中的放射性强度，就能够确定T细胞增殖的能力与强度。

丝裂原诱导的增殖反映

诱导T细胞增殖反映的丝裂原

1. PHA（植物血凝素）

2. Con A（刀豆蛋白 A）

3. PMN（美洲商陆）

技术步骤

1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。

2. 用100g/ml的PHA配造1:10、1:20和1:40稀释液。

3.96孔板当选择一行（共12孔），每孔中参与100?l细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组别离参与一种稀释度的PHA溶液，最后一组加造就液（对照组）。

4. 37°C ，5％CO2，54h。

5. 配造浓度为50?ci/ml的3HTdR。

6. 每孔参与50?ci 3HTdR，持续造就18h。

7.用多孔自动网络仪别离网络每孔细胞于一幼管中。溶化细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。

8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印了局。

9. 扣除本底，推算每一组3个复本的均匀数。

影响成分

1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应查抄细胞活力。

2. 造就液中增长的血清：有些血清可能激活或抑造细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可选取灭活的AB血清。

3. 细胞造就板类型：凭据细胞数量选取分歧状态底部的造就板。

4. 微生物传染：可降低细胞增殖能力。

单向混合淋巴细胞造就反映

道理：T细胞受体可能鉴别同种异型MHC分子。当把2个分歧个别的单个核细胞在体表混应时，能够相互刺激，引起增殖。增殖的强杜纂两者之间MHC的差此外水平成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反映的强度反映2个个别之间MHC差此外水平，并且由于相互鉴别与增殖，了局是2个个别的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞造就试验。

将参与反映之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反映能力，但仍保留刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反映了局仅反映另一方（反映方）的增殖能力。在内容性器官移植时，只需相识受者淋巴细胞对供者MHC的反映能力，所以适合选取单向混合淋巴细胞造就反映。

单向混合淋巴细胞造就试验

步骤

1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。

2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25?g，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的步骤处置刺激细胞。

3. 96孔板中，每孔参与1x105的刺激细胞和1x105反映细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，持续造就18h。阳性对照孔加反映细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3复本。

4. 网络细胞，液闪仪计数，打印了局。

5. 推算相对反映（RR）

（尝试组cpm－阴性对照组cpm）

RR＝—————————————————

阳性对照组cpm－阴性对照组cpm

把稳点

1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应查抄细胞活力。

2. 造就液中增长的血清：有的血清可能会刺激或抑造反映。

3. 本底应幼于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。

抗原诱导的特异性增殖反映

道理:本试验测定T细胞在体表对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可所以初次接触的抗原，也可所以已经免疫过的抗原。常用的测定回顾反映的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破感冒类毒素（TT）。这2种抗原都被通例列入打算免疫接种领域，成人应该对它们有回顾反映。在某些免疫缺点病中，对它们的特异性回顾反映可减弱或隐没。

步骤（以T细胞对破感冒类毒素刺激的增殖反映为例）

1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处置。

2. 96孔板中每孔参与1x105 PBMC和1x104 APC。

3. 每孔中参与系列稀释的破感冒类毒素溶液，分歧孔中抗原终浓度别离为0、1、5、10和20?g/ml。每一种浓度设3复本。

4. 37C°，5％CO2，6天。

5. 加3HTdR，持续造就18幼时，计数。

了径喙释

1. 对于接种过破感冒疫苗者来说，本试验了局呈低反映反映患者对破感冒类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺点。

2. HIV习染者反映低下反映CD4+T细胞削减导致的免疫缺点。

把稳点

1. 造就液中最好用人AB血清。

2. 此T细胞增殖反映必要APC。如使用纯化T细胞，需加5％～10％自身APC。

B细胞产生抗体能力的测定

基础理论:B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体？固迥芄辉谘推渌逡褐屑斐，检测抗体是测定B细胞职能的最沉要的步骤。B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者产生学分歧、接受刺激的抗原分歧，对T细胞的依赖性分歧。由于B2细胞匹敌原的应答依赖T细胞，所以，B细胞产生抗体能力的低下，其缺点也可能发源于T细胞缺点。

丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定

基础理论:人B细胞拥有PWM受体，在体表受到PWM刺激时，产生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞产生抗体的能力能够用ELISA测定造就上清中抗体的量估计，也能够用ELISPOT步骤测定产生抗体的B细胞数量估计。

技术步骤与评价

1. 分离PBMC96孔板中每孔参与1x105细胞和PWM终浓度（1：100）。阴性对照孔内不加pWM。每一尝试设2 复本。

2. 37C°5％CO2造就10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。

3. 网络上清，用ELISA法测抗体。网络细胞，用ELISPOT法测产生抗体的B细胞。

利用实际

1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机造，以及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。

2. 由于B2细胞产生抗原必要T细胞辅助，所以又能够用于检测T细胞的辅助职能。

3. 临床上用于钻研免疫缺点病和自身免疫病患者B细胞分化异常的机造。

把稳点:选取以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离的B细胞，需思考抗体对B细胞产生抗体的影响（推进或抑造作用）。

ELISPOT法

基础理论:ELISPOT全称为酶联免疫黑点试验（enzyme－linked immunospot assay），可用于测定产生IgG和IgM抗体的B细胞。其步骤是用抗原包被固相，而后参与抗原特异性B细胞。若是B细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。参与酶标二抗和显色剂就会显色。一个黑点就代表一个产生抗体的细胞。

技术步骤

1. 抗原包被：37C°2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。

2. 抗体天生细胞造就：参与适量抗体天生细胞，37C°，5％CO2，3～4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。

3. 测定黑点产生细胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。

4 计数：24h后用10～30倍显微镜下计数黑点形成细胞。

评价

1. 在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体传染。

2. 硝酸纤维素膜活络度高于聚苯乙烯。

3. 与ELISA结合使用，能够估计单个细胞的抗体产量。

4 当淋巴细胞受到严沉传染时，也能够使用本法，所以合用于测定组织中抗体天生细胞。

利用实际:用处同ELISA法。本步骤可用于任何可溶性抗原。

ELISA测定各类免疫球蛋白

基础理论:B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，而后在Th细胞产生的各类细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。利用分歧的单抗，结合ELISA步骤，能够测定B细胞产生的抗体的类别。

步骤

1. 包板：96孔板用浓度为10?g/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°过夜。通例洗板，封关。

2. 上样：每孔内参与1:10或1:20 稀释的细胞造就上清液100?l。阳性对照为尺度品，阴性对照为造就液。每试验设2复本。室温造就2h，或4C°过夜。

3. 加酶标二抗：每孔加100?l碱性磷酸酶象征的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温造就2h，或4C°过夜。

4. 显色：洗板，每孔加100?l底物（p－nitrophenyl phosphate）。

5. 自动酶标仪读数，从尺度曲线读出抗体浓度。

评价:ELISA法活络、单一、急剧、特异性高、沉复性好，是测定上清和体液中Ig的首选步骤。碱性磷酸酶象征的二抗显色显著，不用用碱遏制反映，尤其合用于测定体表产生的抗体。

利用实际:ELISA可测定各类体液中的抗体，其了局反映被检个别B细胞职能。测定免疫球蛋白各类亚类的水平有助于鉴定免疫缺点病。

CTL杀伤职能的测定

基础理论:CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞鉴别APC表表MHCI类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒习染细胞时，可能通过细胞接触机造或裂解机造杀伤靶细胞。

1. 细胞接触机造

CTL表白FasL，靶细胞表白Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡蹊径，导致靶细胞殒命。

2. 细胞裂解机造

CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动？帕Ｄび胂赴と诤贤ü硗驴涂帕Ｄ谌菸。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜欢细胞膜上形成孔，造成细胞裂解？帕Ｃ赣盏及邢赴蛲。

51Cr象征法道理

如在将靶细胞与CTL混合之前，吓酌放射性核素51Cr造就，51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中幼分子蛋白质牢凝结合，不能自由从细胞内开释。当靶细胞膜被CTL粉碎后，51Cr被开释进入上清。由于上清中放射性强杜纂细胞杀伤水平呈正比，通过测定上清中放射性强度，就能够判定CTL杀伤能力。

技术步骤

1. 从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。

2. 51Cr象征肿瘤细胞。

3.96孔造就板每孔中参与淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为50:1，25:1，12.5:1。另设最大开释对照（靶细胞加去污剂）和自觉开释对照（不加CTL）。

4. 37C°，5％CO2，4h。

5. 网络上清，?计数器测定放射活性（cpm）。

NK细胞毒性测定

基础理论:NK细胞存在于表周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰硕。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特点是CD16（Fc?RIII A）和CD56（神经细胞粘附分子）。当NK细胞鉴别肿瘤细胞活病毒习染细胞时，CD16分子被交联，引起脱颗粒，并排泄IFN－?和TNF？帕Ｖ泻写┛姿亍⒖帕Ｃ负蚿roteoglycans，引起靶细胞溶胀性殒命和凋亡。NK细胞的CD16与IgG1和IGg3结合，可介导ADCC作用。

NK细胞表白一种能鉴别HLA－A、－B、－C抗原的受体，向细胞发出一致性信号，阻止NK细胞的杀伤活性。当靶细胞不表白或低表白HLAI类分子时，抑造解除，NK细胞活化，杀伤靶细胞。

K562细胞系不表白HLA分子，对NK细胞陕作用敏感，常用作NK细胞的靶细胞，用于检测NK细胞的活性。

技术步骤

1. NK细胞的分离：用抗CD3、CD19、CD14单抗和淘洗法，去除T细胞、B细胞和Mo，获取NK细胞。

2. 加板：步骤同CTL杀伤试验。分歧的是，靶细胞为K562细胞。最大开释组为靶细胞中加去污剂，自觉开释对照组中不加Nk细胞。37C°，5％CO2，4h。

3. 网络上清液，?计数器测各孔cpm值。

4. 推算％溶化值：步骤同CTL法。

评价

1. 本步骤不变，但51Cr传染环境。

2. 从表周血中分离的NK细胞是静止细胞，只能杀死对峙敏感的K562细胞系，不能杀伤其它肿瘤细胞。

3. 冷冻保留影响NK细胞活性，故宜选取新鲜分离的NK细胞。

4. 人血清中含有的IgG会抑造NK细胞的杀伤活性，故造就液中宜使用幼牛血清。