染色体原位分子杂交技术

染色体原位分子杂交技术（Chromosome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization
，FISH）的发展为钻研染色体DNA序列提供了直观而有效的步骤。该技术拥有经济、安全、操作急剧、不变性好及活络度高蹬着点。多色FISH可在统一细胞核内同时显示两种或多种序列
，并可用于间期细胞核染色体的钻研。通过使用分歧类型的探针
，可显示某一物种的全数基因组、特定染色体片段以及单拷贝序列。结合共聚焦激鲜明微镜
，还可对间期细胞核及染色体进行三维结构分析
，从而实现杂交信号的精确检测与定位。

二、探针（probes）

1．基因组探针（Genomic probe）：

人类基因组中含有大量高频沉复序列
，其进化守旧性较低。当以基因组DNA作为探针时
，探针与靶细胞序列中高度沉复序列会优先退火结合
，从而避开守旧的单拷贝序列
，因而杂交出现显著的种属特异性。利用该类探针在人—鼠杂交细胞中可特异性显示人类遗传物质。

2．染色体特异性序列探针（Probe recognizing chromosome specific sequences)：

目前在人类险些所有染色体中均已克隆到特异性沉复序列
，其沉复次数约为100～5000次
，多位于着丝粒区或异染色质区
，形成致密的杂交带
，可用于特异鉴别某一条染色体

3．染色体文库探针（chromosome labraries probe）：

染色体文库网络人类单条染色体的DNA作为探针
，又称整体染色体探针或染色体染探针。单条染色体的获得通常有两种步骤：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株
，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中分离

4．单一序列探针（single-copy sequences probe）：

FISH有一弱点
，就是要求探针足够大
，探针越幼
，杂交位点检出率就越低。欲利用FISH检测存在基因组内的单一序列基因
，最有效的步骤是利用含大插入片段的克隆载体
，如全Cosmids（载约40kb的插入片段）
，更大的YAC载体（载100-800kb插入片段）。若把握好
，幼到2kb的质粒探针亦可用FISH步骤定位
，但效能较低。

三、FISH技术系列

1．24色 mFISH核型分析技术

24色mFISH是近年成立的核型分析技术。其道理是使用5种荧光染料按比例象征探针
，杂交后形成24条染色体各自出现特异的荧光色彩以供核型分析。为钻研人员提供了更丰硕详尽的细胞遗传学信息
，蕴含确定象征染色体的起源、检测微幼的染色体易位和检测复杂的染色体易位
，尤其为肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的步骤。

2．原位杂交显带技术(In situ hybridization banding,ISHB)

为了正确定位原位杂交部位所处染色体及其区带
，染色体必须显带。但无论是先杂交后显带
，还是显带后杂交
，杂交与显带过程回相互影响成效。后来人们把稳到
，人类短距离插入沉复序列中的一种Alu家族
，Alu片段约300bp长
，在基因组中沉复约九十万次
，均匀距离3-4kb就插入一个。有人利用部门Alu序列作为引物
，用PCR步骤扩增Alu之间的DNA
，称Alu-PCR法。但Alu序列在基因组内散布不是随机的
，有些区域比力密集
，有些区域较稀少。只有前者才有PCR产品。人们用Alu-PCR产品作为探针与人类染色体标本杂交
，了局得到类似R带的荧光带型。故人们在进行基因定位时
，只需将主张探针与Alu-PCR探针同时利用
，用分歧色彩的荧光象征
，就可同时显示杂交信号和染色体带型。

3．FISH基因定位（FISH mapping）

基因定位时
，不只必要确定某段靶序列在染色体上的地位
，尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的分列秩序和距离
，能力绘出基因图。通常用同位素杂交：先确定每一靶序列在中期染色体上的地位
，而后凭据它们到端粒的距离确定出线形分列秩序。而用FISH步骤
，两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交
，只有凭据两种色彩杂交位点的相互地位
，就能直接确定秩序。但中期染色体是线形DNA分子经过折叠和包装后形成的
，若两个靶序列相距很近
，例如间距幼于1Mbp
，受包装过程的影响
，它们在线形DNA分子上的分列与在中期染色体上的分列不愿定一样
，甚至可能齐全相反。学者们发现
，靶序列之间在间期核的均匀相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正有关。利用间期核FISH分析不只能排除染色体包装的影响
，还能提高测距的分辨率。

四、FISH的利用

1．基因定位与基因造图（Gene mapping）

道理前面已叙述。FISH已经极大地加快了人类基因定位和基因造图的过程。

2．基因诊断(Gene diagnosis)

精确、直观、了然

3．间期细胞遗传学（Interphase cytogenetics）

4．FISH在肿瘤生物学中的利用

（1）肿瘤细胞遗传学（Onco-cytogenetics）

（2）基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位

（3）病毒基因插入基因组部门的检测：

固然逆转录病毒以激活原癌基由于主
，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产品与抑癌基因蛋白产品相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因出格是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH能够检测到病毒整合到人基因组中的情况
，对深刻钻研病毒致癌机理
，以及检测、防治均拥有沉要意思。

（4）基因的扩增与缺失

原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤钻研的热点。

已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。

抑癌基因的激活方式有：点突变、基因缺失。

FISH为钻研基因的扩增和缺失提供了新的步骤
，能将基因扩增和染色体沉复分隔。