免疫组织化学染色(免疫组化)
川沙总部
一、道理
免疫组织化学技术是凭据抗原与抗体特异性结合的道理，检测组织中的肽和蛋白质的一种技术。现常用以下两种检测步骤：
SP法：
一抗 + 生物素象征二抗 + 辣根酶象征链霉蛋白素 + 辣根酶底物显色
SABC法：
一抗 + 生物素象征二抗 + SABC（链霉蛋白素 + 辣根酶象征生物素） + 辣根酶底物显色
通常来说，SP法特异性较高，SABC法敏感性较高。
免疫组化最终显色反映是通过酶与底物作用天生不溶性色素而实现的，所选用底物与呈色反映亲昵有关。最常用的是DAB,呈棕黄至棕褐色沉淀。
免疫组化
二、资料和试剂
1.试剂：酒精、二甲苯、枸橼酸盐、PBS、一抗、二抗试剂河注DAB、树胶等。
2. 仪器设备： 载玻片、染色缸、湿河注移液器、微波炉、恒温箱、冰箱、显微镜等。
三、染色法式
1.切片脱蜡至水；二甲苯Ⅰ（15分钟）→二甲苯Ⅱ（15分钟）→无水乙醇Ⅰ（5分钟）无水乙醇Ⅱ（2分钟）→90%乙醇（2分钟）→80%乙醇（2分钟）→70%乙醇（2分钟）→蒸馏水（2分钟）。
2. 3% H2O2，室温10-20分钟，灭活内源性酶。(30% H2O2 1份+双蒸水9份混合配造新鲜)
PBS洗2分钟×2次；
3.微波建复：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液PH6.0）电炉或微波炉加热至沸腾后断电，距离2～3分钟后，沉复2～3分钟，自来水浴冷至室温，PBS洗2分钟×2次；
4.滴加正常山羊血清封关液，室温20分钟， 不洗，甩去有余液体。阻断组织与抗体非特异性结合，降低布景染色；
5.滴加Ⅰ抗（浓缩液要适当比例稀释，滴加量要凭据组织大幼，1cmⅩ1cm大幼40ul左右），37℃1-2幼时或4℃过夜；PBS洗5分钟×3次；
6.滴加生物素化二抗, 37℃或室温30分钟，PBS洗5分钟×3次；
7.滴加试剂复合物，37℃或室温30分钟，PBS洗5分钟×3次；
8.DAB显色：使用DAB显色试剂盒,室温显色，镜下节造反映功夫，通常在5分钟之内；
9.流水冲刷；
10.苏木精复染2分钟；
11.流水蓝化15分钟；
12.干燥箱烤干、二甲苯通明、中性树胶封片，置入烤箱烤片。
四、当苦衷项
1.切片要尽量薄、平、无刀痕；
2.滴加试剂前要先甩去切片PBS，再用吸水纸把组织周围的水擦干，预防抗体流失分散，但不能干片。
免疫组化有关试剂：
振动切片封关液(PNBS): （10ml）
终浓度： 储液：
10%NS(二抗种属正常动物血清) NS 1ml
2%BSA 10%BSA 2ml
5%蔗糖 20%蔗糖 2.5ml
+PBS PH7.4 to 10ml
MEMFA：（10ml）
终浓度： 储液：
0.1M MOPS 1M MOPS 1ml
0.1mM EGTA 10mM EGTA 2ml
1mM MgSO4 1M MgSO4 10μl
3.7%PFA 10%PFA 3.7ml
+d2H2O to 10ml
AP-CDS：(100ml)
终浓度： 储液：
100mM Tris-Cl PH9.5 1MTris-Cl PH9.5 10ml
50mM MgCl 1M MgCl 5ml
100mM NaCl 5M NaCl 2ml
0.1% Tween-20 Tween-20 100ml
5mM levamisole 1M levamisole 500ml
+d2H2O to 100ml
HRP-CDS: (1ml)
(1)6.6ml H2O2 in 100ml 0.1M TB PH 7.5
(2)20ml DAB（0.05g/ml in d2H2O）+5ml(1)液+0.1M TB PH 7.5 to 1ml
10%多聚甲醛配造步骤：(100ml)
称取10克多聚甲醛(SIGMA P6148)粉末，置于250ml锥形瓶中，参与80ml 1xPBS，再参与5-6滴（1ml吸头）10N NaOH, 于65°C水浴中溶化3-4幼时，齐全溶化后冷却至室温，调整PH值至7.4, 溶液定容至100ml，过滤后分装成每管4ml 或8ml, 保留于-20°C。使用前将贮液置于80°C水浴中溶化，1xPBS稀释至4%，即可使用。(配好后4°C密关保留，24幼时内使用。)
或直接配造4%PFA, 步骤同上（可不加NaOH促溶，则不用调PH），配好后4°C密关贮存，24幼时内使用。
0.5%明胶处置载玻片步骤：
800ml处置液：
1.溶化4g 明胶和4g硫酸铬钾于 800ml d2H2O中，65°C加热30min左右，使其溶化（不要使溶液沸腾）
2.过滤溶液，并将溶液在室温下搁置至50°C左右。
3.将玻片在溶液中浸提3-4次。
4.将处置的玻片在室温下过夜使其蒸发干，为预防尘埃，用保鲜膜覆盖。
5.130°C烤干3幼时以上。
6.干燥保留。
处置液使用后，可参与0.05%NaN3，4°C保留。下次使用时将溶液加热至50°C即可。
蛋白胶配造步骤：
取新鲜鸡蛋清充分搅拌， 4°C过滤，清液参与等体积无荧光甘油，再参与0.05%NaN3充分混合，分装成每管1ml，-20 °C保留。
荧光封片剂（Mowiol）配造步骤：（约24ml）
将2.4g mowiol、6g甘油和6ml去离子水放入 50ml 离心管中，室温2幼时，直至mowiol齐全长大变通明。加12ml0.2M Tris buffer （pH 8.5），50°C（过夜），直到mowiol齐全溶化。4000-5000 rpm 离心20 minutes。分装成每管1ml，-20°C保留。
分享到：
有关新闻
