大鼠帕金森氏病动物模型的成立——JDB电子生物医药
川沙总部
帕金森氏病(Parkinsonts disease，PD)是常见的中枢神经系统变性疾病，其重要病理变动是中脑黑质细胞变性坏死，导致黑质纹状体系统内多巴胺(DA)含量削减而发病。6一羟多巴胺(6一OHDA)是一种神经毒剂，可选择性粉碎含DA 的神经细胞。目前成立帕金森氏病动物模型最常用的步骤是通过单靶点黑质毁损步骤，此法由于定位禁绝及操作技术不稳等成分，成功率较低。 我们通过纹状体两点注射6-OHDA造备大鼠PD 模型，井对此模型的行为学和状态学进行评价。
1、资料和步骤
1.1 资料
Spraque—Dawley大鼠，雄性，3O只，体沉180～ 230g ；6-OHDA(sigma公司) ；阿朴吗啡(APO，sigma公司) ；兔抗酪氨酸羟化酶(TH)血清(中国科学院上海生物化学钻研所惠赠) ；ABC试剂盒(Vector公司) ；大鼠脑立体定向仪为江湾一1型(上海江湾医疗器械厂)。
1.2 步骤
将30只大鼠随机分为尝试组(25只)及对照组(5只) 尝试组动物用1O％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉后，剪去头部毛，将大鼠固定于三维脑立体定向仪上，切开头皮和皮下组织、骨膜 ；将齿棒设定为一2。4 mm，确定前囟坐标，按包新民的大鼠立体定向图谱确定右侧纹状体两点坐标，第一点坐标是：前囟前1。0，矢状缝右侧3。0，硬膜下4。5 ；第二点坐标是：前囟后1。0，矢状缝右侧4。5，硬膜下6。0。 按上述坐标用微型磨钻开颅后，用微量注射器将4 Fg／uL的6一OHDA(溶于0。2 抗坏血酸生理盐水中)4 分0注入上述两点，注射速度1~uL／min，注毕留针10 min，退针速度为1 mm／min，以防药液溢出。术毕大鼠腹腔注射头孢唑啉(50mg／kg)抗炎。对照组动物仅向两点注射含0。2 抗坏血酸的生理盐水4 L，余操作同前。
1周后起头检测大鼠的诱发旋转行为，每周一次，皮下注射阿朴吗啡(0.05 mg／kg)诱发其旋转行为。动物旋转时以健侧前肢或后肢为支点、身段环曲、首尾相接的原地旋转，伴觅食样作为。 旋转360度为一转(r)，60 min内纪录大鼠向损毁对侧的旋转瞬数。
从术后第1周起头进行大鼠脑组织状态学观察，每周取1只能产生旋转的大鼠的脑组织切片，作TH 免疫细胞化学染色，观察大鼠右侧中脑黑质多巴胺细胞的损毁情况。TH 免疫细胞化学染色步骤：大鼠1O%水台氯醛(500 mg／kg)深度麻醉后，经升自动脉急剧灌注温生理盐水100 mL，而后用4℃ 的4％多聚甲醛(pH=7。4，0。1 mol／L PBS)800 mL灌注前固定，迅速断头取脑，将脑浸入4 多聚甲醛4℃ 过夜，再移入含30 蔗糖PBS中4℃过夜，直至脑组织沉入容器底部，而后作陆续冰冻冠状切片，片厚25 m。TH 免疫细胞化学染色过翟 ；切片用5 BSA 室温孵育1 h TH(1：1500)4℃ 48 h ；IgG(1：800)37℃ 2 h ；ABC(1：100)37℃ 2 h ；DAB显色10 rain。 各步问PBS充分冲刷。 光镜下观察。
2、了局
纹状体内注射6-OHDA 后l周，所有动物都设有诱发旋转{至术后第2局才起头出现明
显的旋转，随后缓慢上升 ；至术后5周才升至较高的水平并维吃旖稳第1、2、3、4、5周动物的旋转次数别离均匀为0。0、3。8、4。9、7。1和8。5 r／rain ；其中有15只动物达到或超过了7 r／rain这一通常选取的尺度，可作为PD模型鼠使用。成功率为6O 。 5只对照组大鼠均没有产生旋转行为。酪氮酸羟化酶免疫组化显示：旋转鼠术后第1周至第5周右侧黑质TH免疫反映细胞逐步削减，各个时期右侧黑质TH免疫反映细胞较对佣显著削减。不旋转鼠右侧黑质和左侧黑质TH 样免疫反映神经元未见显著差距。
3、会商
帕金森氏病的临床症状重要是由于黑质内多巴胺能神经元的渐进性的退行性扭转所造成的，经典PD 模型是通过在大鼠的黑质或内佣前脑束内注射6-OHDA 丽复造的啪。6-OHDA是一种神经毒索，黑质内注射后，它可被大鼠中脑黑质内富含单胺氧化酶的多巴胺能神经元吸收，并在单胺氧化酶作用下转化成自由基而对神经元造成侵害。 从神经解剖学的角度来看，黑质的传出纤维重要形成黑质纹状体投射，即纤维自黑质发出后，沿黑质背内侧上行经下丘脑表侧、内囊内侧部达到尾状核头部和壳核头部，这一通路含多巴胺也是纹状体内多巴胺的重要起源。 若是黑质内多巴胺能神经元被毁损，纹状体内的多巴胺削减，当降至肯定的水平时就会出现相应的类似PD的症状。而对于单例黑质毁损的模型，同侧的黑质纹状体通路被粉碎，纹状体内的神经元失去多巴胺能神经元的摆布，其多巴胺受体便处于一种超敏状态 ；当赐与表源性的多巴胺受体激昂剂如阿朴吗啡后，动物危险侧的反映就强于健侧而无法维吃旖衡，并向健侧旋转，旋转的频率大体与黑质内的多巴胺能神经元的受损水平一致。黑质内注射6一OHDA造备PD模型，有以下不及：(1)由于危险部位紧邻神经元胞体，因而神经元的毁损出现很早，在术后10 rain，利用免疫组化步骤就可观察到多巴胺能神经元的殒命，这一点使该模型与临床PD病人的中脑黑质多巴胺能神经元的渐进性殒命分歧(2)近距离的毁损很难把握水平，若是想仿照早期PD，则多巴胺能神经元的毁损不能超过8O ，用这种步骤很难获得这种部门毁损的模型且模型成功率很低，通常为40 ～50。 鉴于黑质内注射6一OHDA造备PD模型鼠存在的上述不及，我们通过纹状体内注射6一OHDA造备PD模型鼠。由于纹状体是黑质多巴胺能神经元的重要靶区，注射于其中的6。0HDA可被前者的末梢吸收，通过逆轴突转运至黑质内的神经元胞体，在经单胺氧化酶转化成自由基，可选择性地粉碎这些神经元而出现类似PD 的症状“]。 由于6-OHDA 必须通过逆轴突转运能力达到中脑黑质，因而多巴胺能神经元的殒命是一种渐进的过程。 我们用32~g6一OHDA分两点注射后，至术后第2周才起头出现显著的旋转，随后缓慢上升}至术后5周才升至较高的水平并维吃旖稳。第1、2、3、4、5周黑质内TH 阳性神经元存活率逐步削减 ；造备模型成功率达60 。因而无论从状态学还是行为学上来看，这种模型造备步骤所造成的多巴胺能神经元危险简直与临床上PD病人的病程进展类似，是一种渐进的退变过程。 在对模型成功鼠持续1月的观察中，动物的旋转行为没有自觉复原的景象，动物的健康情况(如活动、饮食等)也无恶化的阐发。
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