基因医治是将遗传物质转移到患者的细胞中以达到医治成效。医治性DNA大部门是使用基于腺病毒（Ad），腺有关病毒（AAV）和慢病毒（LV）等病毒载体系统进行递送。随着这些病毒载体作为临床医治剂利用的增长，可扩大的贸易化工艺（尤其是纯化）在被钻研和优化，以最大水平地确保关键质量属性（CQA）的保留。本文综述了病毒载体纯化技术及分歧载体种类的分歧个性对选择最佳单元操作的影响。

病毒载体的种类

每类病毒载体对基因医治中都有自己的挑战与机遇(表1)。腺病毒最初用于基因医治是在20年前，但它们此刻很少在临床利用(它们此刻临床利用并不受欢迎)，由于它们太复杂，好比拥有挑战性的载体设计和系统治理，重大的基因组，以及（最沉要的）高免疫原性(1)。

慢病毒已经在临床试验中显示出利用远景，它们已经用于医治Wiskott-Aldrich综合征，X连锁肾上腺脑白质营养不良和异染性脑白质营养不良(2–4)。慢病毒沉要的作用机造（MoA）是它们能转导割裂和不割裂细胞的能力，从而产生持续的转基因表白和潜在的医治成效。

AAV也被以为是一种有远景的基因医治工具，由于它们没有致病性和免疫原性，同时拥有持续转基因表白和合用于各类细胞的特点[5]。目前，西方国度唯一贸易化的基因医治是来自uniQure的Glybera（alipogene tiparvovec），其基于AAV1并已被用于医治遗传性脂蛋白脂肪酶不足症（LPLD）。
* AAV =腺有关病毒，HSV =单纯疱疹病毒，RCR =有复造能力的逆转录病毒，CNS =中枢神经系统（蕴含神经元和神经胶质细胞），VSV =水泡性口炎病毒，HFV =人泡沫病毒，DSP =下游工艺生物造作方面的思考

基因医治利用必要有能够出产高纯度和生物活性载体的大规模出产工艺，并且能满足化学，造作和节造（CMC）的监管要求。它们应该是不变的、可扩大的、成本效益的，并且极度合用于多种病毒载体（6）。如图1所示，病毒载体的出产由上游和下游工艺过程组成，蕴含几个步骤，取决于产品的病毒个性。

用于基因医治载体的病毒颗粒的上游工艺必要病毒成长和收成，而下游工艺侧沉于病毒载体的纯化。值妥贴心的是，病毒载体的下游纯化占整体造作成本的大部门，并且是病毒载体造作的瓶颈（7）？衫┐蟮南掠喂ひ赵毯吻澹ㄎ⒙耍，捕获（超滤/渗滤），纯化（离子互换层析（IEX）和亲和层析（AF）），和精造（尺寸排阻层析（SEC）和超滤）等几个步骤。

由于每种病毒拥有分歧的生物化学和物理个性，所以病毒基因医治载体的纯化必须凭据各自特点做相应地调整。这个过程必要进行优化，以维持病毒习染性（与产品功效和典型的开释测定亲昵有关）并最大限度得到复原。纯化步骤的选择应该思考病毒粒子大幼和不变性，中性pH下的电荷和相对粒子不变性等特点。必须彻底相识纯化过程，以确定影响最终产品质量的关键步骤。

病毒基因医治载体纯化能够采取分歧的步骤，蕴含超速离心、膜过滤和柱层析法。后两者适合于工艺放大。

超速离心重要用于尝试室规模，不能工艺放大，由于可用的转子通常只有幼容量。超速离心时时导致活性病毒颗粒的迷失，病毒荟萃和剪切力是能够用来诠释的其中两种原因（8）。与膜和柱层析相比，超速离心的自动化也是个有挑战性的难题。它的使用会增长处置功夫和产品降解的风险。

只管柱色谱工具是可扩大的并且常用于生物分子纯化，但它们不适合纯化诸如DNA和病毒等的较大分子。在这种情况下，纯化通常通过0.1μm基质扩散来实现。

膜孔> 3?m的膜吸附器已成为盛行的病毒纯化工具。它们将病毒颗粒吸附到固相上。由于孔径大，膜吸附器能够在更快的流速下工作，从而节约了的大量功夫和商品成本（CoG）（9）。另一个优势是它们能够利用和善的洗脱前提，这增长了保留病毒习染性的可能性（6）。图2说了然若何利用膜吸附器实现病毒纯化，并用珠子作为对比。

纯化色谱的模式

色谱法可进一步分为四种模式，别离利用分歧的机造实现病毒的纯化。IEX是基于位于病毒衣壳表部的蛋白质净电荷。AF利用基质偶联受体或配体与病毒衣壳之间的相互作用。SEC（凝胶过滤）凭据大幼将病毒从DNA，衣壳和蛋白质中分离出来。疏水作用层析（HIC）通过使用水性溶剂的疏水相互作用将病毒衣壳蛋白结合到基质上（10）。

基于载体种类的选择模式

由于每种载体拥有特定的特点，所以某些纯化模式更易于阐扬作用（表2）。为了纯化腺病毒，即Ad5，能够使用上述所有的色谱步骤。由于Ad病毒在中性pH下带负电荷，因而能够使用各类阴离子互换吸附剂进行纯化。


使用阴离子互换剂的IEX也被报路用于几种AAV（11）。固定化金属亲和层析（IMAC）是能够纯化Ad的另一种步骤。该步骤基于将Ad颗粒与结合到柱上的带电锌离子结合。该步骤为纯化AAV提供了几种选择，例如出格合用于AAV2纯化的肝素亲和层析（12）。SEC是合用于精造Ad和AAV5的步骤，HIC能够用高浓度的硫酸铵和其他盐（13）来纯化Ad颗粒。后一种步骤尚未被描述用于纯化AAV血清型（10）。

由于慢病毒带负电荷，所以纯化慢病毒的通例步骤是使用膜吸附器和捕获步骤中使用的基于柱的AEX工具。这个步骤在分歧的病毒载体纯化组中变动最大。慢病毒也能够通过使用肝素亲和层析来纯化，但是它引入了一种动物起源的试剂，在大规模的基因医治出产中应该被裁减[14]。最后，杆状病毒通常在捕获步骤中使用膜基阴离子互换剂，再用阴离子互换膜吸附剂和SEC来纯化。有进展，但依然有很多工作要做 基因医治生物造备中的纯化技术的选择对终产品质量和CoG极度沉要，并且是一个多成分的过程。固然用于基因医治的平台化生物工艺不休涌现，但它们尚未齐全成立起来。

每个载体都必要进行彻底的表征和工艺开发。然而，传统的大规模纯化技术（出格是色谱步骤）极度适合基因医治生物工艺。因而追求将基因工程步骤中的新兴基础科学专业知识与已有的生物加工技术和技术相结合，以更好的服务于这个新兴行业。

我们把握了成立可持续和可获利的基因医治产业所需的工具和技术。但是手中的挑战是若何去最佳配置它们，以加快发展援救性命和将有效的基因医治利用到临床，并且还要有能够通过监管部门的数据和可能承担的成本。