PCR产品的检测

• 凝胶电泳分析：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 酶切分析
• 分子杂交：Southern印迹杂交、黑点杂交
• 核酸序列分析

PCR的反映前提

• 反映温度（变性、退火、延长）
• 反映功夫（变性、退火、延长）
• 循环次数（PCR效能及产品量）

PCR反映的特点

• 特异性强：引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠诚性  
• 活络度高：指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 
• 轻便、急剧：2～4 幼时实现扩增
• 对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 

1.1 PCR技术概述及道理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反映，是在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA为模板，以特定的核酸片段即PCR引物为扩增起点和终点，通过变性、退火、延长等步骤，在体表系统中复造出大量与母链模板中所需的DNA片段互补的子链DNA的过程。
PCR的最大特点是其扩增产品的特异性、扩增效能的活络性、扩增法式的轻便性。引物序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反映了局的关键。PCR技术是一种DNA体表合成放大技术，拥有扩增效能高，扩增特异性高，扩增系统和技术轻便成熟的特点，是当今生物学有关尝试室最宽泛使用的一项技术。

1.1.1 PCR的循环步骤

PCR反映过程现实上是一个温度循环变动的过程，通常蕴含变性---退火---延长三个根基反映步骤，其根基步骤如下：
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至92～96℃以上保温1～3分钟，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反映作筹备；固然变性功夫决定于多种成分模板DNA的复杂性、反映管的几何学、PCR仪的种类甚至反映体积，但是现实经验中，94℃保温3分钟即能够满足绝大部门反映的需要。另表，对于GC含量较高的DNA模板，参与甘油、耽搁功夫、利用核酸类似物能够提高PCR产品的产量。
（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，37～65℃保温0.5～1分钟，寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；这一步的温度取决于引物与靶序列的同源性水平和寡核苷酸引物的碱基组成。引物的摩尔数由于绝对大于靶序列，因而它们与互补序列的配对速度在反映中比模板双链之间的沉新配对要快几个数量级。
（3）引物的延长：DNA模板---引物结合物系统在68～72℃延长保温相应功夫（此步骤具体温度视热不变DNA聚合酶的种类而定，而保温功夫则在思考DNA聚合酶效能的基础上，凭据反映产品的长度决定，如目前最常用的DNA聚合酶Taq酶在72℃下每分钟约能够扩增长度为1Kb左右的DNA片段，因而要扩增两2Kb的DNA片段时本步骤的保温温杜爪设置为72℃、功夫为2分钟），在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反映原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复造道理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复造链。

沉复循环变性---退火---延长三过程，就可获得更多的“半保留复造链”，并且这种新链又可成为下次循环的模板使得每个循环中新扩增的主张片段数量以指数式增长。经过肯定数量的循环之后，待扩主张DNA片段的数量将被扩增放大几百万倍。达到平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

1.1.2 PCR通常反映系统

PCR反映的组分通常蕴含：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反映缓冲液、Mg2+等。目前，PCR反映已经全数在PCR仪中进行，且普遍选取贸易化的PCR试剂盒进行PCR反映，因而通常钻研者只必要筹备自己的模板DNA和PCR引物，而后依照产品说明书进行操作即可；对于PCR系统各个组分的相识是进行PCR尝试的基础，尤其是在扩增了局不梦想的时辰，可依此改进尝试以获得满足尝试需要的扩增了局。

通常通常的PCR反映系统中重要蕴含下列组分：
（1）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，通常尺度分子生物学步骤造备的样品都能够直接作为模板使用，无需出格处置，但应尽量不含有对PCR反映有抑造作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、聚合酶抑造剂、能与DNA结合的蛋白质。必要指出的是，模板DNA的量不能太高，不然扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。另质粒、预先扩增的到的片段等幼片段DNA作模板时，扩增的效能会显著高于基因组DNA为模板的反映，因而在使用幼片段DNA作模板时，要尽量降低模板的量，10-9g至10-12g级即可。
（2）引物：引物在PCR反映中的终浓度通常为1μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产品或产量过低。贸易公司合成的干粉状引物通常可用ddH2O或溶化为100μmol/L，－20℃贮存，使用时按比例参与系统即可。
（3）底物（dNTPs）：dNTPs拥有较强酸性，其贮存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，通常存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配造，反映终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加快反映，但同时增长谬误掺入和尝试成本；低浓度可提高精确性，而反映速度会降低。必要注明的是，dNTPs的浓度扭转会影响有效的Mg2+浓度，因而若dNTPs得浓度增长，Mg2+浓度亦应该增长。
（4）镁离子：Mg2+能影响反映的特异性和PCR的产率。Mg2+的工作浓度为1.5～2.0mM，其对应dNTP为200μmol/L；以Taq酶为例，由于dNTP与Taq酶竞争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑造Taq酶的活性。镁离子的使用是严格的，其作用优于锰离子，钙离子则无效。
（5）无Mg2+buffer：重要有H2O、KCl、Tris组成。Tris用于节造反映系统中的pH值，保险DNA聚合酶的反映活性；不超过50mM的KCl能够降低退火温度，但是过高的KCl会抑造DNA聚合酶的活性。
（6）DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR扩增得以进行的保障，目前的PCR技术中使用的都是热不变性酶，预防了PCR技术利用初期需在每一次变性后沉新加酶的繁琐工作。目前最常用的Taq酶能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，通常用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补准则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子衔接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。Taq酶的弊端是没有3’→5’的表切酶活性，因而没有校对职能，某种dNTP或Mg2浓度过高,会增长其错配率，因而在进行精密PCR尝试室，建议使用有3’→5’的表切酶活性的高保真的聚合酶。聚合酶的用量通常按试剂盒说明书的推荐用量增长即可。
除了以上尺度成分以表，一些钻研者或者试剂盒推荐在系统中增长明胶、TritonX-100或BSA（幼牛血清白蛋白）来增长酶的不变性，可能的原因是它们起着削减PCR管对聚合酶的吸附作用，以使聚合酶尽可能参加到反映中。
另表，甘油、二甲亚砜、甲酰胺能够提高特异性,这些成分可能是通过降低解链和链分离温度使模板变性更容易并提高了引物退火特异性来实现提高PCR反映特异性的主张。

1.2引物设计

1.2.1 PCR引物设计的通常思想

PCR反映扩增成功的一个关键即是引物的正确设计，尤其在目前已有大量PCR试剂盒免去钻研人员对尝试系统、前提的繁复摸索的前提下，钻研者只需自行筹备模板和引物即可。
引物设计的主题思想是在扩增的特异性和效能之间获得平衡。特异性指扩增得到非指标片段的频率；扩增效能指在每一个循环中一对引物引起的扩增产品的产量与理论上应获得的产量的靠近水平。
目前市面上提供大量的引物设计软件，这些软件根基都基于以下几点思考引物质量：可能引起非靶序列的假阳性扩增，引物自身的发卡结构，引物二聚体的形成等，假阳性扩增与引物特异性有关，引物发卡结构和二聚体的形成对扩增效能有较大影响。

1.2.2引物的组成

引物的主体通常是一段5’→3’的与靶序列严格互补的寡核苷酸短链，凭据尝试的分歧主张，很多时辰会在引物的5’增长限度性酶鉴别位点蹬纂本次PCR无关序列或其它各类建饰,这些建饰通常不会影响引物的第一次正常退火和扩增，而在后续的循环中，由于已有可互补的模板，系统亦可正常进行扩增。

1.2.3引物设计时应试虑的几个成分

（1）引物长度：PCR扩增的特异性由引物的长度和退火温度节造，当反映的退火温度靠近Tm值时，18～24个碱基长度的引物有着卓越的特异性。
理论上以为在引物上每增长一个碱基特异性会增长4倍，因而引物越长碱基数越多特异性越凸起，但是引物越长，退火时能够被其引发的模板也会越少，再经过指数扩增期放大后，扩增产品会显著削减。因而若非特殊必要，通常引物的互补序列部门不必要超过25个碱基。
而引物越短，其在退火时结合到靶序列上的几率就越高，因而引物中与靶序列互补部门碱基太少会引起不用要的非指标扩增产品。
（2）GC%和Tm值：Tm值指的是引物与模板结合的双链体的解链温度。较低的Tm值导致引物特异性的失落，这种情况下将出现大量的非特异性扩增产品。Suggs在1981年提出的Tm＝2（A+T）+4（C+G）公式，由于轻便和相对精确一向受到宽大钻研者的好评。对于一协议莫20个碱基的引物，基于上述公式，能够发现当CG%在50%左右时Tm值约在56℃～62℃，较适合进行PCR反映，因而在设计引物时，应选。ˋ+T）和（C+G）数量大体相当的序列。尤其该把稳使高低游两条引物的Tm值尽量靠近，比力梦想的情况是相差2～3℃以内，这样能够使PCR反映中进行退火时高低游引物结合靶序列的效能相当，以获得不变且足够数量的扩增产品。
必要出格指出的是，在进行PCR反映设置退火温度时，不论是公式推算还是软件预测或者引物合成公司提供的Tm值，现实上都只能用于参考，每一个PCR反映的现实退火温度理论上都是未知的，通常第一次扩增时退火温度设置为参考Tm值+2或4℃，之后凭据扩增了局进行调整。
（3）引物在靶序列内的地位：除了有特定而精确的主张片段以表，大部门的尝试中，PCR反映的产品长度是能够在肯定领域内进行适度选择的，凭据PCR产品的用处、模板的特点和所用聚合酶的个性，能够选择相宜的产品长度，通常尝试中的PCR反映通常选择在150～1000bp之间，而若只是为了查抄某段特异性序列则只必要120～300bp就已足够。
在靶序列上选择引物的时辰，把稳避开成串单一碱基的区域，避开陆续的CG序列，尽量选择四个碱基散布较随机的区域，这样能够削减引物自身同源的机遇，预防扩增过程中引物的不用要亏损；同时在高低游两引物之间也不应有互补链存在，不能与非主张扩增区有同源性。另表尤其要把稳3’结尾的序列，若非有特定作用，这段序列肯定要与模板DNA严格配对，末位碱基最好选用A、C、G，由于T错配也能引发链的延长。

1.3 PCR的特异性、效能和忠诚性

PCR的特异性、效能和忠诚性是体现一个PCR尝试的质量的三个沉要指标。特异指一个PCR反映只产生一个扩增产品，即预期的靶序列。效能指每个循环里扩增的现实产品的量与理论上应该达到的量的靠近水平。忠诚是指在PCR反映过程中，由DNA聚合酶诱导的错配是能够忽略不计的。
这三个参数中的每一个都受到PCR反映中多多成分的影响，蕴含缓冲系统、酶、模板甚至PCR循环法式，但最遗憾的是，高特异性的反映前提与高产量的反映前提并不一致，同时高保真也往往导致低产率。因而在设计PCR尝试时，要凭据尝试主张，有针对性地对这三个参数有侧沉地优化。如在片段长度多态性分析时，PCR产品的产量和特异性就比忠诚性沉要；而若是钻研个别DNA分子或罕见突变，忠诚性的沉要性不言而喻。
特异性是PCR的基础，它首先取决于引物设计与模板的精确互补。一套梦想的引物能有效地与靶序列杂交，而与模板中出现的其它序列的杂交能够忽略不计。通常引物与模板中非靶序列产生4个或更少陆续碱基互补都不会在电泳时体现出来。
PCR反映的效能影响特异性产品的堆集，凭据Chien等人给出的靶序列的累积与循环数的函数关系，扩增效能最高的时期为29个循环之前的指数增持久，之后每次循环的效能就起头大大降低，产品终场指数堆集，此时理论上靶序列的拷贝数已达到1012，而1012拷贝的特定序列对于绝大无数分子生物学尝试已满足要求，且PCR的很多利用尤其是定量尝试都要求扩增在指数成持久实现，因而，通常PCR反映都在29个循环之前取出，没有必要再增长循环数。
PCR反映的忠诚性重要与酶有关，固然能够通过扭转反映缓冲液的前提大大提高忠诚性，但是也远比不上更换高保真的聚合酶的成效。聚合酶的高保真能力体此刻其占有3’→5’的表切酶校对活性。必要指出的是，不论是否使用高保真的聚合酶，PCR的过程都有可能有谬误碱基渗入，因而在对忠诚性有要求的尝试中，经PCR得到的序列必须测序验证。

1.4 PCR的优化

在PCR尝试中，最不言而喻的一对矛盾是扩增时产生大量不确定、不必要的产品，或者没有扩增到任何产品，这个矛盾的内容就是PCR的高特异性和高效能所需的前提不一致。
下面给出有利于增长PCR特异性的部门前提，往反方向调整即可增长扩增效能，但是会降低特异性，因而最佳指标是找出两个方向之间的平衡。

有利于增长PCR特异性的调整前提：
（1）使用热启动技术
（2）使用降落PCR技术
（3）优化引物设计
（4）参与或优化加强剂
（5）优化反映系统，蕴含pH值，甚至扭转反映体积
（6）提高退火温度
（7）提高模板的变性效能
（8）降低Mg2+浓度
（9）降低dNTPs的浓度
（10）降低聚合酶的量
（11）降低引物浓度
（12）降低模板浓度
（13）削减循环数
（14）削减每个循环中各部门的功夫
如上所述，通常影响一个PCR反映的前提好多，因而，在现实操作中如果进行全矩阵分析寻找最佳前提将费时费劲，因而，钻研过程中能够只针对有关的重要变量进行调整。在沉点思考引物与模板的配对及酶的忠诚性的情况下，Mg2+浓度和退火温度是对扩增影响最显著的成分，因而能够只针对这两个变量进行单一的幼矩阵分析。降落PCR内容上就是一个在系列梯度温度中寻找到有效退火温度，并适度保障特异性的步骤。

1.5 PCR常见问题

PCR产品的电泳检测与保留
PCR实现后最好立即检测，通常不要超过48幼时；产品保留于－20℃待用，或者纯化后保留。

假阴性，不出现扩增条带
PCR反映的关键环节有：（1）模板核酸的造备；（2）引物的质量与特异性；（3）酶的质和量；（4）PCR循环前提。寻找原因亦应针对上述环节进行分析钻研。
模板：（1）模板中含有杂蛋白质；（2）模板中含有Taq酶抑造剂；（3）模板中蛋白质没有消化除净，出格是染色体中的组蛋白；（4）在提取造备模板时迷失过多，或吸入酚；（5）模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处置，模板核酸提取过程出了弊端，因而要配造有效而不变的消化处置液，其法式亦应固定不宜轻易更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性失落或不够而导致假阴性。需把稳的是有时忘加Taq酶。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不梦想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效能的不合称扩增，对策为：（1）选定一个好的引物合成单元；（2）引物的浓度不仅要看OD值，更要注沉引物原液做琼脂糖凝胶电泳，肯定要有引物条带出现，并且两引物带的亮杜爪大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单元协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；（3）引物应高浓度幼量分装保留，预防屡次冻融或持久放冰箱冷藏部门，导致引物变质降解失效；（4）引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效能影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反映体积的扭转：通常进行PCR扩增选取的体积为20μl、30μl、50μl，或100μl，利用多大体积进行PCR扩增，是凭据科研和临床检测分歧主张而设定，在做幼体积如20μl 后，再做大体积时，肯定要模索前提，不然容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当沉要，如变性温度低，变性功夫短，极有可能出现假阴性，退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效能退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效能。有时还有必要用尺度的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延长温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列产生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性，出现扩增条带与主张靶序列条带一致
有时出现的PCR扩增条带与主张靶序列条带一致，其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不相宜：选择的扩增序列与非主张扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产品为非主张性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需沉新设计引物。
靶序列或扩增产品的交叉传染：这种传染有两种原因：（1）整个基因组或大片段的交叉传染，导致假阳性。这种假阳性可用以下步骤解决：操作时应幼心柔和，预防将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管表。除酶及不能耐高温的物质表，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪优等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反映管和试剂用紫表线照射，以粉碎存在的核酸。（2）空气中的幼片段核酸传染，这些幼片段比靶序列短，但有肯定的同源性
？上嗷テ唇，与引物互补后，可扩增出PCR产品，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR步骤来减轻或解除。

出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大幼不一致，或大或幼，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：（1）引物与靶序列不齐全互补、或引物聚合形成二聚体。（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。（3）酶的质和量，往往一些起源的酶易出现非特异条带而另一起源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时沉新设计引物。减低酶量或调换另一起源的酶。降低引物量，适当增长模板量，削减循环次数。适当提高退火温度或选取二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延长）。

呈显飕状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：（1）削减酶量，或调换另一起源的酶。（2）削减dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增长模板量，削减循环次数。

1.5 PCR的利用

PCR技术自1985年成立以来，发展迅速，阐发出极其宽泛的利用价值.基于PCR的根基道理，很多学者充分阐扬创造性思想，对PCR技术进行钻研和改进，使PCR技术不仅得到了进一步地成熟美满，更在此基础上派生出了很多新的利用领域与步骤。

PCR技术首先在基因工程领域有着不成代替的贡献：
对DNA片段在按特殊要求进行建饰上PCR技术提供了一种比原有技术更快更单一的步骤。由于与沉组DNA技术相比，PCR技术自身就较为单一；并且它还能够通过化学合成寡聚核苷酸引物的步骤更为轻便地扭转DNA的碱基序列，而不需对DNA片段进行限度性内切酶和衔接酶操作；再者，PCR技术还可能很方便地进行序列刷新，如在引物5'端加上一个“增长”序列。此表PCR技术产生的建饰产品效能险些可达100%。
此表通过PCR引物引入DNA序列变异的道理是极度有效的。最为轻便的是它能够使PCR产品的一条链或另一条链或两条链都特异性地象征上放射同位素、生物素或荧光素。它还能够在DNA序列的任一地位上特异性地进行位点代替、缺失、插入或沉组，同时它还能够将正本绝不有关的序列正确地衔接起来，并由此获得可遗传的突变。
近年来，基于PCR的各类新技术不休更新、美满、发展，如原位PCR技术、衔接酶链反映技术（Ligase chain reaction，LCR）、依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录依赖的扩增系统（Transcript-based amplification system，TAS）、象征PCR技术（Labelled Primers，LP-PCR）、彩色PCR技术（Color Complementation assay PCR，CCAPCR）、反向PCR技术（reverse PCR）、不合称PCR技术（asymmetric PCR）以及目前如火如荼的实时荧光定量技术（real time PCR）等等，不仅利用在科研领域，也在动、植物检疫、食品安全、司法鉴定等社会生涯中的方方面面有着越来越大的利用价值。但愿通过自己的致力，使其成为一名玩PCR的高手。

【重要参考书目】
（1）C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒，PCR技术尝试指南．科学出版社：北京，2000
（2）萨姆布鲁克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T．分子克隆尝试指南．第二版．北京：科学出版社，1998