细胞凋亡与坏死是两种齐全分歧的细胞凋亡大局，凭据殒命细胞在状态学、生物化学和分子生物学上的差距，能够将二者区别开来。细胞凋亡的检测步骤有好多，下面介绍几种常用的测定步骤。 

一、细胞凋亡的状态学检测 

凭据凋亡细胞固有的状态特点，人们已经设计了很多分歧的细胞凋亡状态学检测步骤。
1、光学显微镜和颠倒显微镜
（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变幼、变形，细胞膜齐全但出现发泡景象，细胞凋亡晚期可见凋亡幼体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 
（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质宰割成块状和凋亡幼体等典型的凋亡状态。
2、荧鲜明微镜和共聚焦激光扫描显微镜
通常以细胞核染色质的状态学扭转为指标来评价细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合长短嵌入式的，重要结合在DNA的A-T碱基区。紫表光引发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 
DAPI为半通透性，用于通例固定细胞的染色。贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度通常为0.5 ~1mg/ml。 
了局评价：细胞凋亡过程中细胞核染色质的状态学扭转分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部门染色质出现浓缩状态
；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化
；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡幼体(图1)。 

3、透射电子显微镜观察
了局评价：凋亡细胞体积变幼，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度围绕，出现很多称为气穴景象（cavitations）的空泡结构(图2)
；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化
；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡幼体。 

图2 

二、磷脂酰丝氨酸表翻分析（Annexin V法） 

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表表，露出在细胞表环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin象征，以象征了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧鲜明微镜可检测细胞凋亡的产生。

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过齐全的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI可能透过细胞膜而使细胞核红染。因而将Annexin-V与PI匹配使用，就能够将凋亡迟早期的细胞以及死细胞分辨隔来。

图3 

步骤 
1、悬浮细胞的染色：将正常造就和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，参与100ul Binding Buffer和FITC象征的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再参与PI（50ug/ml）5ul，避光反映5min后，参与400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（通常不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2、贴壁造就的细胞染色：吓酌0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3、爬片细胞染色：同上，最后用荧鲜明微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
了局： 

当苦衷项
1. 整个操作作为要尽量柔和，勿使劲奏乐细胞。
2. 操作时把稳避光，反映结束后尽快在一幼时内检测。 

三、线粒体膜势能的检测 

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导分歧的细胞产生凋亡，而线粒体跨膜电位的降落，被以为是细胞凋亡级联反映过程中最早产生的事务，它产生在细胞核凋亡特点（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不成逆转。
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的加强或减弱注明线粒体内膜电负性的增高或降低。
步骤：将正常造就的细胞和诱导凋亡的细胞参与使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。
当苦衷项
1． 始终维吃旖衡染液中pH值的一致性，由于pH值的变动将影响膜电位。
2． 与染料达到平衡的细胞悬液中若是含有蛋白，他们将与部门染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。 

四、DNA片段化检测 

细胞凋亡时重要的生化特点是其染色质产生浓缩,染色质DNA在核幼体单元之间的衔接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上阐发为梯形电泳图谱(DNAladder)。细胞经处置后，选取通例步骤分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。若是细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）使DNA象征，而后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色体DNA片段的测定
细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过肯定分子量大幼的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁徙速度一样。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大幼来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁徙模式称之为"膝行"。因而，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用通常的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常选取脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个步骤是在凝胶上表加正交的交变脉冲电场。每当电场方向扭转后，大的DNA分子便滞流在膝行管中，直至新的电场轴向沉新定向后，能力持续向前移动。DNA分子量越大，这种沉排所必要的功夫就越长。当DNA分子变换方向的功夫幼于电脉冲周期时，DNA就能够按其分子量大幼分隔。
参考文件 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 测定
步骤：收成细胞（1X107）沉淀，细胞裂解液，13000rpm′5min,网络上清，1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h，蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜，14000rpm′15min，最后将沉淀溶化在TE buffer中，加DNA Loading Buffer，1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并拍照，了局： 

参考文件 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析
步骤：网络细胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，流式细胞仪分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变动。
了局： 

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

利益：敏感度高，适合于检测少量样本，幼部门凋亡细胞。如临床活组织检测。 

五、TUNEL法 

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH结尾，可在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物象征到DNA的3'-结尾，从而可进行凋亡细胞的检测，这类步骤称为脱氧核糖核苷酸结尾转移酶介导的缺口结尾象征法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。由于正常的或在增殖的细胞险些没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少可能被染色。TUNEL现实上是分子生物学与状态学相结合的钻研步骤，对齐全的单个凋亡细胞核或凋亡幼体进行原位染色，能正确地反映细胞凋亡典型的生物化学和状态特点，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、造就的细胞和从组织中分离的细胞的细胞状态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的钻研中被宽泛选取。 

六、Caspase-3活性的检测 

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着极度沉要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的很多蹊径中阐扬职能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的大局存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个幼亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和殒命细胞，caspase-3的活性显著降落。
1、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
步骤：
网络细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封关，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反映1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-象征的羊抗鼠IgG或AP象征的羊抗鼠IgG室温反映1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。 

了局： 

 

2、荧光分光光度计分析
道理：活化的Caspase-3可能特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。凭据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被引发荧光，短肽被水解后开释出AMC，自由的AMC能力被引发发射荧光。凭据开释的AMC荧光强度的大幼，能够测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的水平。
步骤：收成细胞正
；虻蛲鱿赴，PBS洗涤，造备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反映1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（引发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
了局： 

3、流式细胞术分析
步骤：收成细胞正
；虻蛲鱿赴?PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC 37°C反映1h UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和均匀荧光强度。

了局： 

七、凋亡有关蛋白TFAR19蛋白的表白和细胞定位分析 

TFAR19（PDCD5）是由本钻研室在国际上首先报导的一个占有自己知识产权的人类新基因，前期的职能钻研批注，它是推进细胞凋亡的加强剂。利用荧光素（FITC）象征的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表白水平及定位钻研发现，凋亡早期TFAR19表白水平增高并出现急剧核转位景象，陪伴着细胞核状态学的变动，持续较长功夫，在凋亡幼体中依然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）表翻和细胞核DNA的片段化，提醒TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期产生的事务之一。进一步的钻研证明，凋亡早期TFAR19的核转位拥有普遍意思，分歧细胞凋亡早期均出现TFAR19高表白和核转位。这为钻研细胞凋亡早期所产生的事务，提供了一种新的技术和指标。

（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析
资料试剂：
FITC象征的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。
仪器：低温水平离心理, 37°C水浴箱，荧鲜明微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计

步骤：
1:悬浮细胞的染色：
（1）收成正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）参与PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（4）参与200ml胎牛血清，室温反映30min。
（5）参与5ml FITC象征的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反映30min
（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm 10min。

了局观察：将细胞沉淀滴片，荧鲜明微镜及共聚焦激鲜明微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的均匀荧光强度。 

2：贴壁细胞的原位染色
（1） 贴壁成长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有干净盖玻片），让其爬片成长，待长到
50%~80%满时，凋亡诱导剂处置细胞。
（2） 将分歧功夫点处置的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。
（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧鲜明微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

了局观察  

3：临床病理切片的染色、检测。
4：原代细胞的造就、检测。
5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的散布及定位

（二）TFAR19蛋白的表白与临床疾病
1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的分歧时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。

资料和试剂：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封关液： 3%BSA（用洗涤液配造）
4. 酶标抗体的稀释：用封关液稀释
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g

柠檬酸 0.51g
DDW 100ml

6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml

OPD 2mg
30% H2O2 2ml

7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 沉组人TFAR19, HRP象征的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板机 

操作步骤

1. 用包被Buffer稀释的沉组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（通常24h以上）。
2. 洗涤Buffer洗板三次，参与封关液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
过夜。
3. 洗涤Buffer洗板三次，参与分歧稀释度的病人血清（3个沉复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封关液为阴性对照。
4. 洗涤Buffer洗板三次，参与1：2500稀释的HRP象征的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗涤Buffer洗板三次，参与显色液，100 ml/well，避光反映10~15min。
6. 参与H2SO4终止反映，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比力病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表白水平。

2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表白水平。