在绝大无数药物作用靶点中，酶类靶点占据沉要职位。本文以酶催化反映的根基化学道理为起点，系统概述并论述酶学钻研中的几个主题概想——Km、kcat 和 Ki 及其测定步骤
；进一步分析活络酶学筛选步骤开发的关键步骤
；并综述分歧类型酶抑造剂的作用机造，以及在尝试检测过程中各类抑造剂的 IC?? 与 Ki 之间的关系。

酶是性命体内化学反映的生物催化剂，可能在生理温度和常压前提下显著加快化学反映速度。险些所有细胞性命活动过程均依赖酶的参加以提高反映效能。特定酶活性或表白水平的异常（加强或缺失）均可能导致生理职能错乱并引发疾病。因而，在药物研发过程中，酶不仅是沉要的作用靶点，也是极具开发潜力和临床价值的靶点。

近年来，多种以酶为靶点的药物获得了显著的临床疗效。例如，吉利德公司在中国上市的慢性丙型肝炎医治药物索华迪（索磷布韦），其靶点为 NS5B RNA 聚合酶，对 HCV 1、2、3 和 6 型拥有显著抗病毒活性，治愈率可达 92%–100%
；又如晚期结直肠癌的一线医治药物伊立替康，其代谢活性产品 SN-38 是 DNA 拓扑异构酶Ⅰ抑造剂，通过不变拓扑异构酶Ⅰ-DNA 复合物，引起 DNA 单链断裂，从而阻断 DNA 复造并抑造 RNA 合成，阐发为细胞周期 S 期特异性毒性。

此表，首款获得 FDA 核准的双药 HIV 医治规划 Juluca 中，Dolutegravir 为 HIV-1 整合酶链转移抑造剂（INSTI），而 Rilpivirine 则是一种 非核苷类逆转录酶抑造剂（NNRTI），两者协同作用显著提高了抗病毒疗效。

基于上述布景，若何成立一种轻便、高通量且靠得住的酶抑造剂筛选步骤，成为本文沉点探求的问题。为此，本文将首先回首酶催化反映的根基道理，并在此基础上发展对有关酶学参数及筛选步骤的系统会商。

绝大无数酶学反映可用如下的简化模型进行描述：

E 代表酶（enzyme），S 代表底物（substrate），P 代表反映产品（product）。ES 为酶与底物在催化反映起头前形成的中央复合物，即酶–底物复合物。E和S形成ES复合物的反映是可逆反映的过程，k1是E和S形成ES复合物的结合速度常数，相当于配体受体结应时的Kon或者Ka
； k-1是ES解离形成E和S的解离速度常数，相当于配体受体结应时的Koff或者Kd（关于以上概想可参考笔者前期的文章--生物职能学筛选评价技术之亲和力评价篇）
；ES解离形成E和P的过程在反映初期通常以为是不成逆的过程，反映产品E会被反映系统中的过量的S捉拿。k2是ES形成E和P的速度常数，也被称之为Kcat,相当于配体受体结应时的Kon或者Ka酶催化效能：

酶相对于其底物的催化效能通常用 kcat/Km 来暗示。 通常而言，Km 值越幼、kcat 值越大，催化效能越高。Km（米氏常数）值的化学性质是E和S可逆反映过程中的解离平衡常数KD,反映的是E和S亲和力的强弱，Km值越幼亲和力越强，效能越高。Kcat值是ES解离形成E和P的速度常数。Km值和Kcat值测定

米氏方程描述了在稳态反映前提下酶催化反映中初始反映速度V和底物浓度 [S]的有关关系：

当V蹬宗1/2的 Vmax时，底物浓度 [S]为Km值。

在现实的检测过程重要蕴含以下几个步骤：

1. 少量固定浓度的酶（nM或者pM级别），梯度浓度稀释的底物（底物浓度相对于酶浓杜咨远远过量，mM到μM）进行分组，酶催化反映
；

2. 每个分组对酶催化反映的产品进行动力学检测（酶标仪进行荧光，吸光度检测或者HPLC检测），拔取各分组信号功夫的线性反映区域进行V推算
；

3. 拔取梯度浓度稀释的底物动力学检测的线性区域的斜率作为初始反映速度V进行数据米氏方程拟合，拟合图形的平台期为Vmax, 1/2的Vmax时V对应的底物浓度值是Km值。处置了局示意图如下：

4. 当酶催化反映达到最大速度时，S远弘远于E，所以所有的E均被S捕获，E和S的逆反映速度可忽略不计，[ES]=[E]

Vmax=[ES]*Kcat=[E] *Kcat,所以Kcat= Vmax/[E]

以上是Km和Kcat的测定和推算过程，值妥贴心的是在现实的尝试过程中必要把稳以下几点：

1.必须是动力学读数，拔取初始反映的线性段的斜率作为初始反映的速度。终点法读数的了局好多时辰并不成靠，应为酶催化反映随着功夫的进行底物的亏损，反映速度会从匀速到非均速变动，若是选取终点法可能得到不真实的初始速度，如下图：

2. 必须确认仪器的检测线性，当酶催化反映，产品的量过多时，超过仪器检测的线性区域时，检测的产品的量禁绝，影响到后续参数的推算，如下图：

酶学药物筛选模型的成立

酶学筛选步骤的几个主题参数蕴含酶，反映环境，底物和抑造物。通常来讲反映环境必要查阅文件进行调研，确定PH值，离子强度，洗涤剂等对酶活的影响，底物能够凭据酶催化道理选择天然底物，也能够选择合成底物（底物的选择和后续配套的检测步骤缜密有关）。一个酶学步骤的开发可能涉及到以下一些成分：

底物的选择和配套的检测方式，如下图某蛋白水解酶，其识此外位点是氨基酸线性表位，能够人为合成多肽，在其N端和C端别离参与荧光基团和淬灭基团，正常状态下或者酶活抑造状态，该多肽在酶标仪340nm引发时，其发射光会被淬灭基团吸收，在405nm无信号产生
；酶催化反映会将该多肽剪切，当酶标仪340nm引发时，405nm有信号产生。 

又如某病毒逆转录酶，合成RNA模板和对应引物，在其引物上进行生物素象征，其中碱基上进行Ru象征，随着酶催化的逆转录反映的进行，引物上不休有Ru象征碱基上去形成核苷酸序列，通过亲和素的板子捉拿引物，检测Ru信号致反评价酶的催化和抑造的活性。

酶，底物浓度的选择和反映功夫的选择

当酶对应的底物确定以来，拔取少量的酶浓度（pM或者nM）对底物进行Km测定，拔取底物的Km浓度作为筛选的反映浓度，拔取该浓度下线性的反映功夫内的某个功夫点作为反映终止或者检测的功夫。酶和梯度稀释的化合物进行预孵育后，参与Km浓度的底物，反映一段功夫后进行检测，这个就是通常酶学筛选模型。

酶抑造剂机理钻研

对于靶点酶的抑造剂，重要能够综合为三类（Competitive竞争性, Noncompetitive非竞争性, Uncompetitive不竞争性）

Competitive竞争性抑造剂只和自由的酶结合，通常情况下和底物共同竞争结合位点（活性中心），当然也有竞争性抑造剂和底物互斥的情况出现，两个中只有一个可能和自由的酶结合。在竞争性抑造剂存在的情况下，酶相对于底物的Km和Vmax测按时，测得得表观Km值增长，Vmax值不变，如下图所示，几种竞争性抑造剂的图示： 

Noncompetitive非竞争性抑造剂

非竞争性抑造剂能够和自由的酶结合，也能够和酶-底物复合物结合，抑造剂结合的位点和活性中心位点不在一样的表位，最终也会导致酶催化活性的失落。在非竞争性抑造剂存在的情况下，酶相对于底物的Km和Vmax测按时，测得得表观Km值不变，Vmax值降低，如下图所示：

Uncompetitive不竞争性抑造剂

不竞争性抑造剂只和酶-底物复合物结合，形成失活的抑造剂-酶-底物复合物。酶相对于底物的Km和Vmax测按时，测得得表观Km值降低，Vmax值降低。如下图所示：

分歧类型抑造剂Ki和IC50之间的关联

Ki描述的是抑造剂和酶的结合强弱，是抑造剂和酶的解离平衡常数，是个状态函数，不会受到反映系统中底物浓度的影响，分歧尝试得到的Ki值拥有可比性
；而IC50则是在特定酶学检测步骤中酶活抑造一半时抑造剂的浓度，凭据分歧类型的抑造剂，底物浓度可能对IC50产生影响，分歧尝试得到的IC50值不具可比性。凭据分歧类型的抑造剂，在梦想前提下（酶浓度远远幼于底物浓度进行反映），Ki和IC50的关系如下：

分歧抑造剂类型IC50和反映系统中参与的底物浓度的关系示意图如下： 

瞻望：

绝大无数性命活动的调控均是有酶的参加，对酶的选择性抑造能够调控细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等很多沉要的生物学过程，如JAK抑造剂，IDO抑造剂等在临床钻研或者市场上证了然其价值或者潜在的价值。相始学反映的化学道理，搭建相宜的酶学筛选模型
；表征酶抑造剂的分歧抑造机理，也有助于轻微分辨分歧抑造机理药物可能起到的差距性的临床获益。

利用酶催化反映进行体表的职能学检测也是常用的工具，如ELISA中HRP酶的催化显色，细胞活性检测时琥珀酸脱氢酶催化的CCK8检测，汇报基因检测过程中luciferase酶催化的化学发光等，相识其化学道理和动力学反映过程有助于职能学步骤学开发，优化检测步骤的前提。

酶催化反映是理崩溃表生物职能学评价系统承先启后的一环，此反映过程描述了是从Binding(affinity)转换到function（potency）的过程，且在梦想前提下此过程是线性传递的，即产品天生量是ES的量和Kcat的乘积，Vp=[ES]*Kcat。与之相对的，蛋白相互作用过程中，只有Binding(affinity)，大部门受体介导的细胞学效应寂仔Binding(affinity)，也有function（potency），但是由Binding(affinity)到function（potency）之间的传递往往长短线性的，每种细胞由于其细胞内环境蛋白的表白差距性会导致由胞表结合引起的刺激非均一放大形成差距性效用。下一篇笔者将会对更为复杂的细胞学有关测定步骤进行会商。

参考资料

《Guidance for Assay Development & HTS》

SECTION V: ENZYMATIC ASSAYS

SECTION XII: MECHANISM OF ACTION ASSAYSFOR ENZYMES